目的  在毕赤酵母细胞中稳定表达经连接肽连接的HBsAg和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白（glycoprotein，g）E的重组蛋白，并进行初步纯化及颗粒性验证。方法  构建HBsAg-gE的四拷贝重组表达质粒，经酶切线性化后电转化至毕赤酵母KM71细胞中，甲醇诱导表达。采用免疫印迹法和ELISA检测表达的重组蛋白，经蔗糖密度梯度离心和凝胶排阻层析初步纯化后进行透射电子显微镜观察。结果  HBsAg-gE四拷贝重组质粒经双酶切鉴定正确。表达的重组蛋白经免疫印迹法检测，可以与小鼠抗gE单克隆抗体及抗HBsAg多克隆抗体特异性结合，相对分子质量约90 000。经ELISA检测HBsAg呈阳性。蔗糖密度梯度离心后，重组蛋白聚集在40%至55%区带之间，在透射电子显微镜下观察到直径约20 nm左右的病毒样颗粒结构。结论  成功在毕赤酵母中表达了HBsAg-gE病毒样颗粒，为在酵母系统中表达水痘-带状疱疹重组疫苗奠定了基础。

目的  建立人3型副流感病毒（human parainfluenza virus type 3，HPIV3）感染小鼠模型，并研究其免疫应答特点。方法 用HPIV3兰州分离株HPIV3LZ1728C19毒株鼻腔接种BALB/c小鼠，每天检测体温和体质量。用ELISA检测血清HPIV3特异性IgG、IgA滴度，实时定量PCR检测鼻腔灌洗液和肺组织病毒滴度，流式细胞术检测外周血、肺、脾淋巴细胞中的HPIV3特异性IFN-γ CD4⁺和IFN-γ CD8⁺ T细胞，酶联免疫斑点法检测淋巴细胞中分泌HPIV3特异性IgG/IgA的B细胞，肺组织切片观察病理变化。结果 感染后第3天，小鼠鼻腔和肺的病毒负载量分别到达峰值10⁴拷贝/ml鼻洗液和10⁷拷贝/g组织，肺部发生炎症性病理变化。感染组早期体质量增加显著滞后于对照组（感染后第3天：t=4.64，P<0.05）。感染组血清中HPIV3特异性IgG（t=2.94，P<0.05）和IgA水平（t=18.66，P<0.05）显著增高，外周血、肺、脾均出现HPIV3特异性抗体分泌淋巴细胞。病毒感染诱导小鼠肺产生记忆性IFN-γ CD8⁺ T和IFN-γ CD4⁺ T细胞应答，脾和外周血产生IFN-γ CD4⁺ T细胞应答。结论 成功建立了HPIV3感染小鼠动物模型，感染小鼠产生了显著的肺黏膜体液和细胞免疫应答。

目的  研究两种狂犬病疫苗免疫程序对抗体效价的影响。方法  将献血浆者按照基础免疫剂量分成两组，第1组初次免疫2剂，第2次、第3次各免疫1剂；第2组初次、第2次、第3次均免疫1剂；两组间隔时间一致。在初次免疫后第14、28、42、56、70、84天，检测献血浆者血浆中的狂犬病抗体效价，考察是否符合单人份生产用原料血浆抗体效价标准（≥8 IU/ml）。结果  初次免疫后第14、28、42天，第1组献血浆者抗体阳转率更高，差异具有统计学意义（c²值分别为4.65、8.69、4.11，P＜0.05）；仅在初次免疫后14 d内，第1组抗体效价≥8 IU/ml的比例更高，差异具有统计学意义（c²=5.45，P＜0.05）；距初次免疫第56、70、84天两组血浆抗体效价差异不具有统计学意义（P＞0.05）。结论  在免疫程序期间，大剂量的狂犬病疫苗免疫程序能取得较好的免疫应答效果，但在长期抗体水平方面与小剂量注射程序无明显差异。

 目的  建立检测聚乙二醇化胰高血糖素样肽1类似物（polyethylene glycolylated  glucagon like peptide -1 analogue，PEG-GLP-1a）生物活性的报告基因法，并对该方法进行验证。 方法 将人胰高血糖素样肽1受体表达载体和分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase, SEAP）报告基因载体瞬时共转染HEK293T细胞，培养后加入PEG-GLP-1a刺激细胞分泌SEAP，使用SEAP报告基因检测试剂盒进行测定，并验证其专属性、准确性、精密度、稳定性等指标。 结果  人胰高血糖素样肽1受体和SEAP双载体瞬时共转染的HEK293T细胞对PEG-GLP-1a具有强反应性。使用该方法测定PEG-GLP-1a具有良好的专属性。加标回收率为97.6%~102.23%，准确性较好。不同测定日期的日内半数效应浓度的变异系数都小于10.22%，不同测定日期的日间半数效应浓度的变异系数都小于13.02%。 结论  报告基因法可以用于PEG-GLP-1a的生物活性检测。

目的 筛选阳性对照病毒在不同细胞基质中的最适感染复数（multiplicity of infection，MOI）,以优化水痘减毒活疫苗外源病毒因子检查法（细胞培养法）。方法 致细胞病变观察：将水痘-带状疱疹病毒以0.005、0.010、0.020的MOI分别接种至Vero、2BS和MRC-5细胞，培养7 d后观察细胞病变，病变较典型时对应的MOI即为最适MOI。血细胞吸附观察：将牛副流感病毒3型以0.1、0.2、0.4的MOI分别接种至Vero、2BS、MRC-5细胞，培养7 d后分别于2~8 ℃和20~25 ℃放置30 min，观察血细胞吸附，血细胞吸附较典型时对应的MOI即为最适MOI。结果 对Vero、2BS、MRC-5细胞，当水痘-带状疱疹病毒MOI分别为0.020、0.010、0.005时，30%~50%细胞出现典型病变；对Vero、2BS、MRC-5细胞，当牛副流感病毒3型MOI分别为0.1、0.2、0.4时，30%~50%细胞出现典型血细胞吸附。结论 水痘-带状疱疹病毒感染Vero、2BS和MRC-5细胞的最适MOI分别为0.020、0.010、0.005；牛副流感病毒3型感染Vero、2BS和MRC-5细胞的最适MOI分别为0.1、0.2、0.4。

目的  考察不同胰蛋白酶及消化后是否弃去胰蛋白酶对Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney，MDCK）细胞消化效果的影响，并评价培养基中添加胎牛血清对减轻胰蛋白酶细胞毒性的作用。方法  选用5种胰蛋白酶分别消化MDCK细胞，消化5 min后弃去胰蛋白酶为弃去组，不弃去为保留组。观察消化过程，记录细胞达到不同状态所需的时间。完全消化后，检测细胞的活率、结团率、直径。以不同浓度的胰蛋白酶消化MDCK细胞，按培养基是否添加胎牛血清分为含血清和无血清组，检测细胞活性。 结果  重组胰蛋白酶消化时间长于动物源胰蛋白酶。保留和弃去组细胞活率均值都大于94.77%，结团率均值均大于34.56%，直径均值分别为17.33和16.97 μm且差异有统计学意义（t=4.632, P<0.001）。细胞活性随胰蛋白酶添加量呈现梯度变化。含血清和无血清组的细胞活性差异有统计学意义（t=12.545, P<0.001）。 结论  5种胰蛋白酶均可完全解离贴壁MDCK细胞，其中重组胰蛋白酶消化时间较长，作用温和，比较适合生产。弃去胰蛋白酶再继续消化的做法可行且有益，胰蛋白酶浓度对细胞活性有影响，胎牛血清可以减轻胰蛋白酶的潜在毒性。 

 目的  确认洁净区使用消毒剂的消毒方式，保证对洁净区的有效消毒。方法  选取新洁尔灭和过氧乙酸对洁净区进行消毒，取样检测微生物限度并检测消毒剂残留，考察消毒面积、接触的不同材质、消毒剂作用时间对消毒效果的影响。结果  采用任一种消毒剂，每4平方米更换1次完全浸湿消毒剂的无尘抹布，消毒剂与待消毒界面接触5 min后，微生物消杀效果最佳；使用清洁剂进行二次擦拭后，消毒剂残留量不影响人员健康及产品质量。结论  确定了适用于洁净区有效消毒的消毒方式。

目的  建立Sabin株毒种制备脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine, IPV）生产工艺并评价其免疫原性。方法  采用Vero细胞培养Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒，制备3价Sabin株IPV（Sabin strain IPV, sIPV）。通过ELISA检测D抗原含量。检测病毒滴度，电子显微镜下观察纯化病毒形态并电泳鉴定，分析抗原纯度，同时检测纯化原液宿主细胞残余DNA和蛋白含量。通过大鼠体内接种法比较sIPV和野生株IPV免疫原性，并观察中和抗体滴度变化。结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型收获液D抗原含量分别为2 437、365、1 253 DU/ml，病毒滴度分别为每毫升8.4 、7.8和7.9 lg半数细胞培养物感染量。纯化病毒抗原纯度均﹥99%。电子显微镜下观察可见直径20~30 nm病毒颗粒，电泳鉴定正确。纯化原液的残余宿主细胞DNA和蛋白含量分别12.3 pg/500 μl和9.8 ng/ml。sIPV 3针免疫后在大鼠体内诱导产生抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体的几何平均滴度分别为9 397.8、554.7和4 668.4，与野生株IPV相比Ⅰ型明显增高（t=-3.429,P=0.004），Ⅱ、Ⅲ型无明显差别，初免后19周内均维持在较高水平。结论 建立了稳定的sIPV生产工艺，制备的sIPV免疫原性较好。

目的  建立准确快速检测灭活疫苗中β-丙内酯（β-propiolactone , BPL）含量的分析方法。方法  采用气相色谱法进行BPL含量检测，用外标法计算BPL含量。对分析方法的专属性、系统适应性、线性和范围、准确度、精密度、检测限、定量限、耐用性进行验证。结果  BPL溶液和供试品溶液在相应保留时间内可见BPL峰，阴性对照溶液未出峰。BPL峰5次进样峰面积相对标准偏差小于2%且与其他峰分离度大于1.5。BPL的浓度在1.11~35.52 μg/ml范围内与峰面积成线性关系。浓度分别为2.22、4.44和8.88 μg/ml的供试品溶液回收率在97.3%~106.9%之间，相对标准偏差均小于3%。检测限为0.30 μg/ml，定量限为0.49 μg/ml。结论  建立的BPL检测方法具有良好的专属性、系统适应性、线性和范围、准确度、精密度、耐用性，符合定量检测的需求。

目的  建立麻疹减毒活疫苗细胞工厂多次收获工艺。方法  采用细胞工厂培养2BS细胞，以不同感染复数接种麻疹病毒，绘制病毒生长曲线以确定适宜感染复数。在感染后不同时间点，微量滴定法比较仅收获胞外病毒与收获胞内外病毒的滴度。比较单次收获与多次收获病毒的滴度，并对原液和冻干成品进行稳定性试验。结果  确定细胞工厂培养麻疹病毒的适宜感染复数为0.010～0.100。感染后108～168 h细胞外病毒滴度与含胞内病毒滴度无明显差异（t=0.524,p＞0.05）。多次收获得到的病毒总量高于单次收获。单次收获与多次收获得到的病毒原液-65 ℃保存3个月，病毒滴度下降均不超过每毫升0.3 lg半数细胞培养物感染量，冻干成品37 ℃保存1周，滴度下降均不超过每毫升0.5 lg半数细胞培养物感染量。结论  建立了细胞工厂培养麻疹减毒活疫苗的多次收获工艺。

 目的  制备麻疹病毒抗血清，用于含麻疹病毒成分的联合减毒活疫苗的检定。方法  制备麻疹病毒Edm-3株病毒收获液，采用弗氏佐剂，对家兔和豚鼠分别经皮下多点或腹腔途径免疫3针，加入制备抗血清，经除菌过滤和补体灭活后，对抗血清进行中和效价、中和能力、细胞毒性及特异性检测。结果 用4种免疫方式制备的抗血清中和效价均高于1∶320，其中豚鼠背部皮下组中和效价为最高，达到1∶2 459；将豚鼠背部皮下组抗血清稀释至1∶320，能够完全中和每毫升2 000 半数细胞培养物感染量的麻疹病毒，同时对Vero细胞、RK-13细胞、MRC-5细胞无细胞毒性，且不可中和腮腺炎病毒、风疹病毒和水痘病毒。结论采用Edm-3株麻疹病毒收获液，通过背部皮下多点方式免疫豚鼠可制备具有较高中和效价的麻疹抗血清，可用于疫苗检定。

目的  比较乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度单瓶平行检测与多瓶混样检测之间的差异性，为进一步完善中国药典中相关技术要求奠定基础。方法  1人份和5人份乙型脑炎减毒活疫苗各抽取20批，同一批次疫苗样品随机取样6瓶，3瓶用于病毒基础滴度检测，3瓶用于病毒热稳定性滴度检测。检测方式分别为3瓶单瓶平行检测与3瓶混样检测：单瓶平行检测是从3个单瓶中取样分别检测，所得结果取几何均值；混样检测是从相同的3瓶疫苗中分别取样至适宜的容器中进行混合，再取样进行病毒滴度检测。对采用单瓶平行检测的几何平均滴度值和混样检测滴度值进行配对t检验，判断两者之间的差异是否存在统计学意义。结果  两种滴度检测方式得到的疫苗基础滴度值间的t值为0.72，P值为0.48；热稳定性滴度值间的t值为0.34，P值为0.73。两种检测方式的结果差异无统计学意义。结论  单瓶平行检测与多瓶混样检测方式的差异无统计学意义，均可用于乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度的检测。

目的 探讨采用复苏等量分装的标准贮备菌株培养18~24 h后配制的菌悬液作为生物制品微生物验证用菌液的可行性。方法 制备等量分装的标准贮备菌株，选择保藏0、3、6、9、12、13个月对其复苏后菌液进行菌落计数，对计数结果进行单因素方差分析。结果 分析显示，储存3、6、9、12、13个月的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌计数与0个月比较无显著差异，F值分别为2.24、2.21、0.58、1.59，P值均大于0.05，计数结果稳定。结论 采用等量分装的标准贮备菌株复苏后配制菌悬液，可作为生物制品微生物验证用菌液，菌液浓度稳定。

目的 建立和验证有效分离5型肺炎球菌结合物原液（结合物原液）中游离多糖的方法，以供测定游离多糖含量。方法 通过游离多糖添加回收率试验以及氯化钠浓度对咔唑-硫酸法吸光度值影响试验，选择结合物原液中游离多糖和多糖-蛋白结合物分离时最佳的氯化钠浓度；通过蛋白回收率试验筛选出该条件下所能沉降蛋白质的浓度范围；比较标准曲线经脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate，NaDC）/HCl法处理前后吸光度值的变化，验证NaDC/HCl法对多糖含量检测的影响；对所建立方法的专属性、精密度及准确度进行验证。结果 NaDC/HCl法处理结合物原液时的最佳氯化钠浓度为0.15 mol/L；结合物原液中蛋白浓度在100 μg/ml以内，NaDC/HCl法能实现蛋白质的完全沉淀；NaDC对多糖含量检测无干扰；该方法专一沉淀蛋白质，而对游离多糖无影响；准确度验证试验的回收率在93.17%~102.59%之间；日间以及日内的精密度变异系数均小于10％。结论 NaDC/HCl法能充分分离结合物原液中的多糖-蛋白结合物和游离多糖，具有良好的准确度和重复性，适用于5型肺炎球菌结合物原液中游离多糖含量的测定。

目的 观察肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）疫苗III期临床试验接种5年的免疫持久性。方法 在III期临床试验免疫原性亚组中，对完成全程两针次免疫的免前抗EV71中和抗体阴性人群进行免疫后5年采血并检测抗EV71中和抗体，对0 d、56 d、8个月、14个月、26个月、64个月同时具有抗EV71中和抗体检测数据人群评价免疫持久性。结果 共614名受试者完成5年免疫持久性血样采集并获得中和抗体检测结果，其中490名受试者同时具有0天、56 d、8个月、14个月、26个月、64个月抗EV71中和抗体检测数据，疫苗组和安慰剂对照组分别为235名和255名。EV71疫苗免疫后5年，疫苗组抗EV71中和抗体阳性率（100.00%）和抗体几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）（369.57）均高于对照组（69.02%和55.58）。分别以抗体滴度8、16、32为阳性判定标准，疫苗组阳性率（100%、99.57%、97.87%）均高于对照组（69.02%、61.96%、59.61%）。对不同年龄亚组进行分析，6~11、12~35月龄受试者免疫后疫苗组5年抗EV71中和抗体阳性（滴度≥8）率（均为100.00%）和抗体GMT（367.14、370.64）均高于对照组（66.67%、71.27%和53.43、63.66）。在EV71疫苗免疫后的各个时间点，疫苗组抗EV71中和抗体阳性率和GMT均高于对照组。结论 该EV71疫苗两针基础免疫后能够诱导良好的免疫原性，在免疫后5年依然保持较好的免疫持久性。

目的  制备重组肠道病毒71型（enterovirus A71，EV-A71）疫苗（汉逊酵母）抗原冻干参考品，用于重组EV-A71疫苗（汉逊酵母）的抗原含量测定。方法  选取检定合格的重组EV-A71疫苗（汉逊酵母）原液，加入冻干保护剂，冷冻干燥制备重组EV-A71疫苗（汉逊酵母）抗原冻干参考品，对其进行保护剂抗原含量标定，并对其进行反复冻融试验，37 ℃、2~8 ℃和-20 ℃稳定性研究。结果  制备的抗原冻干参考品鉴别试验、无菌检查结果均符合规定，水分含量为1.4%。经标定，几何均值为2 146 U/ml，几何变异系数为7.2%。10次反复冻融，抗原含量仍无明显变化；37 ℃放置3个月，抗原含量无明显变化；2~8 ℃和-20 ℃分别放置30个月，抗原含量仍较为稳定。 结论  制备了一批稳定的、均一性良好的抗原冻干参考品，可以用于重组EV-A71型疫苗（汉逊酵母）抗原含量测定。

目的  研究四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种的传代稳定性，确保毒种适用于疫苗生产。方法  将WHO推荐的季节性流感疫苗甲型H1N1和H3N2、乙型BV和BY病毒株（原始种子批）在鸡胚中传代扩增，制备生产用主种子批和工作种子批毒种。按中国药典2015年版三部的要求对毒种进行检定，包括鉴别试验、病毒滴度和血凝滴度测定、外源微生物检查等。将毒种连续传10代，用反转录PCR扩增第2、3、4、5、10代病毒鸡胚尿囊液中的血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）基因片段，并进行序列测定，分析传代过程中HA和NA的核苷酸和氨基酸序列同源性。结果  主种子批和工作种子批毒种的抗原性均与推荐的病毒株一致。各型病毒滴度均>6.5 lg半数鸡胚感染量/ml，血凝滴度均≥1：160。2个种子批的支原体和无菌检查结果均为阴性，主种子批外源性禽白血病病毒和禽腺病毒检查结果亦为阴性。毒种在鸡胚中连续传代后，各型病毒株HA和NA的核苷酸序列同源性均>99%，氨基酸序列同源性均为100%。结论  本研究的四价流感病毒裂解疫苗生产用毒种具有良好的传代稳定性，可用于疫苗生产。

目的  通过强制降解试验，对细胞工厂与转瓶培养两种工艺制备的麻疹减毒活疫苗进行加速稳定性可比性研究。方法  取细胞工厂与转瓶培养工艺制备的麻疹减毒活疫苗单次收获液和原液各3批于25 ℃保存10 d，疫苗成品3批于37 ℃保存10 d。按照中国药典2015版三部和企业标准进行病毒滴度检定。利用Minitab 19比较两种工艺产品的病毒滴度降解曲线。结果  所有样品的降解曲线均符合麻疹病毒的热敏感性。2种工艺制备的麻疹减毒活疫苗单次收获液病毒滴度第1组分别下降1.51和1.56 lg细胞培养半数感染量（CCID₅₀）/ml，第2组均下降1.33 lg CCID₅₀/ml，第3组均下降1.54 lg，原液分别下降1.20和1.43 lg CCID₅₀/ml，成品分别下降1.33和1.30 lg CCID₅₀/ml。2种工艺产品的降解曲线相似。结论   细胞工厂与转瓶培养工艺生产的麻疹减毒活疫苗具有相似的加速稳定性。

目的  初步建立以人二倍体细胞KMB17为培养基质的F基因型腮腺炎减毒活疫苗细胞工厂工艺。方法  分别使用细胞工厂和细胞培养瓶，以含体积分数5%和10%牛血清的培养基将KMB17细胞培养至单层后计数，并按不同感染复数（multiplicity of infection, MOI）接种F基因型腮腺炎病毒，观察病毒增殖情况，初步确定细胞工厂工艺最适MOI和病毒收获时间。按不同方法洗涤细胞，在无血清培养基条件下，对两种培养方式制备的腮腺炎减毒活疫苗半成品和成品进行病毒滴度检测、热稳定性试验及其他相关质量指标的检测。结果  在细胞工厂中获得了生长状态良好的KMB17细胞，经洗涤后，在MOI为0.020时，培养7~9 d后可获得滴度较高的病毒收获液，经过滤、冻干，成品病毒滴度较稳定，其他质量指标经检测均符合中国药典2015年版。结论  初步建立了细胞工厂制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的生产工艺。

 目的  对多重实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）进行反应体系筛选和方法探索，使其用于G1—G4型轮状病毒VP7基因的快速分型和定量分析。方法  设计G1—G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针，以特异性体外转录RNA为模板，筛选多重qPCR反应体系，建立多重qPCR方法。采用单因素方差分析和配对样本t检验对多重与单重qPCR检测结果进行比较。结果  经筛选，得到6组三重qPCR反应体系和1组四重qPCR反应体系。所建立的三重和四重qPCR中，除四重qPCR的G1型参数〔标准曲线决定系数（R²）为0.982、扩增效率为89.221%〕略低于要求外，G2—G4型的标准曲线R²均＞0.99，扩增效率均在90%至110%之间；检测灵敏度达102拷贝/μl。多重与单重qPCR检测同一样本的相关性较好（R²＞0.95）。三重与单重qPCR（t值为1.420~25.786，P值均>0.05）、四重与单重qPCR（t值为2.505~4.851，P值均>0.05）检测结果间的差异均无统计学意义。结论   建立的多重qPCR可同时对3种以上目的基因进行分型和定量检测，为未来多价轮状病毒疫苗及混合病毒样本中毒株的快速分型和定量检测方法的建立提供了借鉴。

目的 分别用新型复合型层析介质Capto Core 400和传统介质Sepharose 6FF纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒（Sabin strain poliovirus，sPV）去除宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）和DNA，并且比较纯化结果及工艺参数。方法  用Capto Core 400与Sepharose 6FF纯化Vero细胞培养的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sPV浓缩液。分别检测纯化后sPV的D抗原含量、HCP残留量和DNA残留量，计算D抗原回收率、HCP和DNA去除率。结果 Capto Core 400与Sepharose 6FF纯化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sPV的D抗原回收率差异均无统计学意义(t值分别为1.09、1.08、1.02,P值均>0.05)，但前者的Vero细胞HCP(t值分别为3.15、3.23、3.54)和DNA去除率均高于后者(t值分别为3.41、3.25、3.62)，且差异有统计学意义（P值均小于0.05）Capto Core 400与Sepharose 6FF的介质使用体积比为1/20，上样后纯化时间比为1/25，工作缓冲液使用量比为1/4，工艺线性流速比为10，每升介质上样量比为20，最大耐压力比为2。结论  对比Sepharose 6FF，Capto Core 400可以更有效地去除Vero细胞HCP与DNA，各个工艺参数得到了优化，提高了sPV层析纯化的工作效率，并节约时间和成本。

目的  探讨发酵罐酸洗钝化对百日咳杆菌生长和产毒的影响。方法  定期对百日咳发酵罐进行酸洗钝化处理，去除其表面附着的代谢螯合物。通过检测后续培养收获物菌浓度（550 nm吸光度值）、一次盐析物沉淀量、发酵产物中百日咳毒素（pertussis toxin，PT）和丝状血凝素（filamentous haemagglutinin，FHA）含量，比较分析判断酸洗钝化对发酵培养和产毒的影响。结果  对处理前后各连续10批相关指标进行比较，处理后菌体550 nm吸光度均值由4.663提高至5.490，一次盐析沉淀量均值由4.84 g/L提高至5.90 g/L，PT平均含量达到3.3 μg/ml，FHA平均含量达到7.6 μg/ml，处理前后各连续10批菌体浓度和一次盐析沉淀量数据采用t检验计算出P值分别为0.03和0.05，各项数据差异均有统计学意义（P≤0.05）。结论  定期对发酵罐进行酸洗钝化可有效改善百日咳杆菌发酵及产毒水平。

目的  评价昆明市西山区疫苗接种的安全性和预防接种服务质量。方法  通过中国免疫规划信息管理系统收集2014—2018年西山区疑似预防接种异常反应（adverse event following immunization，AEFI）个案数据，采用描述性方法对相关监测指标及发生特征进行流行病学分析。结果  2014－2018年昆明市西山区共报告AEFI 294例。辖区10个街道办事处均有病例报告，无疫苗接种事故报告。年均AEFI报告发生率12.27/10万剂；其中一般反应167例，占报告病例数的56.80%，报告发生率为6.97/10万剂；异常反应79例，占报告病例数的26.87%，异常反应报告发生率3.3/10万剂，无死亡病例。异常反应以荨麻疹、斑丘疹、过敏性皮疹、麻疹猩红热样皮疹为主（66例，0.28/10万剂），卡介苗引起腋下淋巴结肿大（4例，0.17/10万剂）、热性惊厥（3例，0.13/10万剂）、血小板减少性紫癜（3例，0.13/10万剂）。属于严重的异常反应7例（卡介苗引起肺部感染1例、热性惊厥3例、血小板减少性紫癜3例），发生率为0.29/10万。结论  西山区AEFI监测的敏感性逐年提高，疫苗接种的安全性和接种服务质量好。

目的  探讨重组抗人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，Her2）单克隆抗体（单抗）的酸碱异质体对其生物活性和亲和力的影响。方法  分别用过氧化氢、肽-N-糖苷酶F、羧肽酶B对抗Her2单抗进行氧化、脱糖、酶切处理。用阳离子交换高效液相色谱法和毛细管等电聚焦电泳分析抗Her2单抗的电荷异质体，使用微量差示扫描荧光法分析抗Her2单抗的热稳定性，用细胞增殖抑制法和表面等离激元共振技术分析抗Her2单抗的亲和力。结果  脱糖处理抗Her2单抗的酸性电荷异质体增加了5.58%，与免疫球蛋白G Fc受体1（high affinity immunoglobulin gamma Fc receptor Ⅰ，FcGR1A）的亲和力明显减弱，亲和力常数为9.032×10^-8 mol/L。氧化和酶切处理抗Her2单抗的热稳定性降低，去折叠温度分别为63.6和59.5 ℃，均低于未处理抗Her2单抗（66.7 ℃）。结论  3种处理均会使抗Her2单抗产生电荷异质性，脱糖处理抗Her2单抗与FcGR1A的亲和力减弱，氧化和酶切处理抗Her2单抗的热稳定性降低。

 目的  建立一种检测重组抗IgE单克隆抗体（单抗）轻链互补决定区中天冬氨酸异构化程度的疏水作用层析（hydrophobic interaction chromatography, HIC）方法。方法  采用木瓜蛋白酶酶切抗IgE单抗，产生抗原结合片段（fragment of antigen binding, Fab）和可结晶片段作为HIC方法的样品。筛选不同品牌及官能团的色谱柱，优化流动相的组成及洗脱梯度，研究样品于5 ℃和﹣20 ℃条件下的稳定性；同时用强制破坏的方式考察该方法的稳定性检测能力。并对该方法的专属性、精密度、线性和准确度进行了验证。结果  采用TSKgel Butyl-NPR色谱柱、流动相甘油含量为5%时色谱图的分离度较好。样品在进样器（5 ℃）中放置24 h或在-20 ℃中放置48 h可保持稳定。该方法能检出强制破坏样品的各成分含量随时间的变化，且专属性良好，重复性及中间精密度均符合规定，Fab段各峰的线性决定系数均≥0.990且准确度均在90%~110%。结论  建立的HIC方法可有效分析单抗制品天冬氨酸异构化程度。

目的  探索特异性靶向CD19的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞的构建与制备方法，并研究其体外杀伤靶细胞的效果。方法  通过基因合成和分子克隆手段构建anti-CD19-CAR片段并将其插入plenti6.3慢病毒载体，利用293FT悬浮细胞系包装慢病毒并转染人外周血单个核细胞来源的CD3⁺ T细胞，通过流式细胞术鉴定转染效率,并通过实时无标记细胞分析法和细胞计数试剂盒8检测anti-CD19-CAR-T细胞体外杀伤效果。结果  获得了表达抗CD19的单链抗体基因的慢病毒，病毒滴度可达3.2×10⁸ 噬斑形成单位/ml。经慢病毒转染的CD3⁺ T细胞在体外培养14 d后，细胞扩增效率达(60.2±11.5)倍，anti-CD19-CAR-T细胞阳性率达90.57%。经检测，anti-CD19-CAR-T细胞均可有效杀伤CD19⁺靶细胞。结论  建立了基于无血清悬浮细胞系的anti-CD19-CAR慢病毒包装系统，成功构建靶向CD19抗原的CAR-T细胞，能特异性杀伤CD19+肿瘤细胞。

目的 基于细胞基质分析新建人二倍体细胞MRC-5主细胞库，并通过主细胞库变更前后所制的水痘减毒活疫苗（水痘疫苗）可比性研究，分析新建主细胞库对水痘疫苗质量和稳定性的影响。方法 对新建MRC-5主细胞库、工作细胞库和生产终末代细胞按照中国药典2015年版和企业质量标准进行抽样检定，并传代至超高代次细胞进行传代稳定性研究，对比细胞生长与细胞计数。用新建主细胞库连续试生产3批水痘疫苗并进行工艺验证，分析疫苗原液及成品的质量结果，并考察水痘病毒基因序列和产品稳定性。结果 新建主细胞库、工作细胞库及其他各代次细胞在传代过程中生长良好，细胞计数正常，检定结果均符合质量标准。试生产的水痘疫苗工艺合格，变更前后生产的疫苗水痘病毒基因序列无差异；病毒滴度均为4.0 lg噬斑形成单位（plaque-forming unit，PFU）/0.5 ml，热稳定性试验结果均为3.4 lgPFU/0.5 ml，水分含量均不高于1.5%，符合企业注册标准；质量稳定性趋势基本一致。结论  建立的人二倍体细胞MRC-5主细胞库各项检定结果合格。用新细胞库试生产的水痘疫苗质量和稳定性与变更前的一致。

目的  对皮内注射用卡介苗（卡介苗）关键质量指标进行关联性分析，为生产工艺控制提供一定的依据。方法  用统计软件（Minitab 17和SPSSAU）对211批卡介苗的菌种代次、半成品沉降率、半成品活菌数、成品活菌数、成品效力和成品渗透压摩尔浓度等关键质量指标进行统计分析，探寻各指标间相互影响的规律。结果  第6、9和12代卡介菌生产的卡介苗成品活菌数均值分别为5.07×10⁶、5.49×10⁶和6.02×10⁶ 菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）/mg，Pearson相关系数为0.200（P<0.05），成品活菌数随卡介苗生产用菌种代次的升高而略有增加。半成品沉降率处于0.00%~7.99%、8.00%~12.00%和12.00%~20.00%的卡介苗成品活菌数均值分别为5.57×10⁶、5.52×10⁶和5.06×10⁶ CFU/mg，Pearson相关系数为-0.182（P<0.05），成品活菌数随半成品沉降率提高而略有降低。半成品活菌数处于1.00×10⁷~1.99×10⁷、2.00×10⁷~2.99×10⁷和3.00×10⁷~4.00×10⁷ CFU/mg的卡介苗成品活菌数均值分别为4.61×10⁶、5.69×10⁶和6.53×10⁶ CFU/mg，Pearson相关系数为0.537（P<0.05），成品活菌数随半成品活菌数增加而显著增加。成品活菌数处于1.00×10⁶~3.99×10⁶、4.00×10⁶~5.99×10⁶和6.00×10⁶~8.00×10⁶ CFU/mg的卡介苗成品效力均值分别为17.61、16.51和16.55 mm，Pearson相关系数为-0.187（P<0.05），成品效力随成品活菌数增加而先略有降低再趋于平稳。成品活菌数处于1.00×10⁶~3.99×10⁶、4.00×10⁶~5.99×10⁶和6.00×10⁶~8.00×10⁶  CFU/mg的卡介苗成品渗透压摩尔浓度均值分别为363.61、363.21和368.68 mOsmol/kg，Pearson相关系数为0.210（P<0.05），成品渗透压摩尔浓度随着成品活菌数增加而略有升高。结论  在企业标准范围内，成品活菌数受半成品活菌数的影响较大，受菌种代次、半成品沉降率的影响较小。成品活菌数对成品效力和成品渗透压摩尔浓度的影响较小。

目的  建立并验证测定14型肺炎球菌多糖（pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14，PS14）浓度的双抗体夹心ELISA。方法  采用Protein G亲和层析纯化兔血清，得到兔抗PS14多克隆抗体（多抗）。以鼠抗PS14单克隆抗体（单抗）为捕获抗体，兔抗PS14多抗为检测抗体，碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为二抗，PS14为参考品建立双抗体夹心ELISA法。确定鼠抗PS14单抗和兔抗PS14多抗的工作浓度，建立标准曲线，并验证该方法的准确性、精密度和特异性，考察佐剂对该方法的影响。结果  鼠抗PS14单抗的最适工作浓度为5 μg/ml，兔抗PS14多抗的最适工作浓度为1 μg/ml，标准曲线的范围为9.375 ~ 600.000 ng/ml，线性良好，相关系数为0.999。测定多糖样品的PS14回收率为110% ~ 140%，多糖蛋白结合物样品的PS14回收率为90% ~110%。平均批内和批间精密度分别是5.64%和7.14%。13价结合物混合样品的PS14回收率为85% ~100%；含有佐剂的疫苗样品的PS14回收率为85% ~110%。结论  成功建立了双抗体夹心ELISA法，该方法准确性、精密度、特异性良好，且检测结果不受佐剂的影响，具有一定耐用性。

目的 用Passing-Bablok回归分析同一厂家不同批次宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）残留检测试剂盒测量差异性。方法 用3个不同批次（A、B、C）试剂盒在检测浓度范围内测定不同浓度样品的HCP残留。应用Passing-Bablok回归分析测定结果。结果 批次A与批次B、C之间测量结果相关系数均>96%（P<0.01）。批次A和B测定结果回归等式为Y=－0.39+1.00×X，截距95%置信区间（confidential interval，CI） －0.67～0.24，斜率95% CI 1.00～1.01；批次A和C测定结果回归等式为Y=－2.23+1.02×X，截距95% CI －1.16～－4.4.8，斜率95% CI 1.00～1.04。结论 批次A和B测定结果一致性良好，批次A与C测定结果存在误差。Passing-Bablok回归可用于不同批次间试剂盒检测差异性分析。

目的  构建表达甲型H5N1禽流感病毒（H5N1 avian influenza A virus，H5N1 AIAV）NIBRG14株结构蛋白的重组痘苗病毒，为研制新型人用流感疫苗奠定基础。方法  通过反转录PCR扩增H5N1 AIAV NIBRG14株的血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）编码基因，并将改造的HA、NA基因克隆至痘苗病毒穿梭质粒 pSCCK。在重组质粒与痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tiantan，VTT）于Vero细胞中发生同源重组后，筛选同时表达HA和NA的重组痘苗病毒（rVTT-HA/NA），并对其进行鉴定。结果  反转录PCR扩增的HA和NA基因大小约分别为1 700和1 400 bp，与预期相同。DNA测序证实，改造的HA和NA序列正确。对获得的rVTT-HA/NA进行PCR及测序表明，HA和NA基因正确插入VTT。蛋白质印迹显示，rVTT-HA/NA感染的Vero细胞表达的HA和NA能与相应的抗体发生反应。表达的HA具有血凝活性，血凝滴度为1∶32。结论  重组痘苗病毒rVTT-HA/NA可稳定表达H5N1 AIAV NIBRG14株的HA和NA。

目的 对国产水痘减毒活疫苗进行质量分析，判断疫苗的安全性和有效性。方法 取2019年生产的102批水痘减毒活疫苗，进行鉴别试验、外观、pH值、渗透压摩尔浓度、水分、病毒滴定、热稳定性、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量、无菌、异常毒性、细菌内毒素含量的检查。结果 各项检查结果均符合《水痘减毒活疫苗制造与检定规程》和中国药典2015年版三部相关要求，病毒滴定和热稳定性试验结果均在3.4 lg噬斑形成单位/0.5 ml以上。结论  国产水痘减毒活疫苗是安全有效的。

 目的 通过研究3个批次无菌异丙醇在3种不同洁净度的环境中开瓶后，瓶内外观、无菌状态及异丙醇含量是否受到环境影响，初步确定无菌异丙醇开瓶后有效期。方法  从3个批次无菌异丙醇中每个批次随机选取162瓶，每个批次分别放置在A级、D级无菌室，无级别库房各54瓶。喷瓶的喷嘴始终处于打开状态，每个工作日进行3次喷雾操作。在第0、1、7、14、21、30天，检测异丙醇溶液的外观性状；采用薄膜过滤法测定异丙醇溶液中微生物的污染情况；采用气相色谱法测定异丙醇含量，并用独立样本t检验方法进行统计学分析。结果  实验期间所有异丙醇溶液外观无变色、无沉淀、无悬浮物，气味无变化，未出现微生物污染；异丙醇含量为体积分数（69.98~70.17）%，达到标示含量。通过统计学分析，异丙醇含量差异无统计学意义（t值0.07~2.18，p值均＞0.05）。结论  异丙醇在A级、D级无菌室和无级别库房开瓶后使用时间建议不超过30 d。

目的 比较不同公司生产的无血清培养基对病毒性疫苗生产用Vero细胞培养效果，及基因工程胰蛋白酶的细胞消化效果，以判断是否适用。方法 实验组用VirusPro Vero-A培养基进行Vero细胞的培养，用Trpzyme消化细胞。对照组用VP-SFM培养基进行细胞培养，用TrypLE Select消化细胞。两组Vero细胞以相同密度接种在T175培养瓶中，以相同的培养条件和传代方法在T175瓶和细胞工厂中各培养3代。培养期间观察细胞的上清液、形态以及汇合度，消化后检测细胞活率并计算细胞收获量。采用配对t检验比较两组消化液的pH值、总消化时长、37 ℃消化孵育时长、细胞活率以及细胞收获量。结果 两组细胞生长状态均良好。配对t检验显示，实验组消化液的pH值（6.99）、总消化时长（17.28 min）和37 ℃消化孵育时长（6.93 min）均值均大于对照组消化液的（分别为6.75、12.34 min、3.30 min），细胞活率（94.79%）及细胞收获量（T175瓶：3.91×10⁷个；细胞工厂：1.90×10⁹个）均值均高于对照组的（分别为90.20%、3.33×10⁷个、1.26×10⁹个），且差异有统计学意义（t值分别为9.17、3.46、2.98、2.31和4.38，P值均<0.05）。结论 实验组无血清培养基培养效果较好，基因工程胰蛋白酶细胞消化液温和、细胞损伤小，均适用于Vero细胞。

目的 用响应面法对马来酰亚胺活化相对分子质量40 000的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（MAL-PEG_40K）修饰胰高血糖素样肽1类似物（glucagon-like peptide-1 analog，GLP-1a）的反应条件进行优化。方法 对GLP-1a浓度、GLP-1a/MAL-PEG40K摩尔比、反应液pH值、反应温度、反应时长进行单因素试验。以前3个条件为自变量， PEG修饰率为响应值，根据中心组合试验设计原理，研究各自变量及其交互作用对PEG修饰率的影响。通过高效液相色谱法分析PEG修饰率，依据回归分析确定各反应条件的最优值。 结果 GLP-1a与MAL-PEG_40K的最佳反应条件为：GLP-1a浓度2.5 mg/ml，GLP-1a/MAL-PEG_40K摩尔比1∶1.25，反应液pH 8，反应温度4 ℃，反应时长60 min。该优化条件下，GLP-1a的PEG修饰率可达91.0%。结论 响应面法获得了GLP-1a与MAL-PEG_40K的最佳反应条件。

目的 探讨pH值、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）含量和离心条件对PEG4000粉末用于去除人C1酯酶抑制剂（C1 esterase inhibitor，C1-INH）制备原料中的IgM效果的影响，并通过对羧甲基（carboxymethyl，CM）离子交换层析中洗脱盐离子浓度的筛选，分离活性与非活性C1-INH。方法 向不同pH值的C1-INH制备原料中加入不同质量分数的PEG4000，于不同条件下离心后，用特定蛋白检测仪对离心后上清液中IgM和C1-INH含量进行检测，确定PEG沉淀法纯化C1-INH的最佳条件。将离心后上清液调节pH后作为CM离子交换层析上样样品，使用不同盐离子浓度的洗脱液对活性C1-INH进行分离，确定最佳的盐离子浓度。结果 在弱酸性pH（6.8）下，当PEG4000质量分数为12%，离心条件15 000×g、25 ℃、20 min时，IgM去除率>99%，且C1-INH的回收率>80%；在盐离子浓度为200 mmol/L时，产物中C1-INH的比活性最大（4.43 IU/mg），且绝大多数杂质蛋白得以去除。结论  优化条件下PEG4000能有效去除C1-INH制备原料中的IgM，且能保持较高的C1-INH回收率；CM离子交换层析能对活性与非活性C1-INH进行有效分离，并去除大多数杂质蛋白。

目的 在白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产车间玻璃瓶清洗剂的变更中，引入质量风险管理，对新清洗剂进行风险分析与评估，以确保更换清洗剂对产品质量无影响。方法 运用风险评估工具对新清洗剂进行相应风险评估，根据风险级别制定风险控制措施，对新清洗剂进行验证，确认其清洗效果以及对产品的影响。结果 清洗后玻璃瓶淋洗水中细菌内毒素含量≤0.25内毒素单位/ml、总好氧微生物计数≤100菌落形成单位/ml、总霉菌酵母菌计数≤10菌落形成单位/ml、总有机碳≤1.5 μg/cm2（淋洗水和擦拭取样）、电导率≤1.3 µS/cm，结果均符合要求。结论 在变更控制中运用质量风险管理，指导变更控制措施的制定和变更内容的实施，保证了新清洗剂的风险可接受且产品质量不受变更影响。

目的  应用低血清培养基在水痘减毒活疫苗生产过程中进行细胞和病毒培养，观察培养效果，验证其对疫苗生产的适用性。方法  采用低血清培养基培养MRC-5细胞和水痘病毒Oka株，以传统培养基的生产为对照，比较细胞生长、病毒感染情况及原液病毒滴度和牛血清白蛋白残留量。采用t检验对结果进行比较。结果  在相同工作细胞库细胞复苏的情况下，低血清培养基与传统培养基培养的细胞和病毒形态，没有明显的差异。低血清培养基与传统培养基培养得到的水痘病毒原液病毒滴度均为5.0～5.1 lg噬斑形成单位/ml，差异无统计学意义（t=1.00，P>0.05）；但低血清培养基生产的水痘病毒原液中牛血清白蛋白残留量（12~19ng/ml）显著低于传统培养基生产的（39~46ng/ml）（t=8.51，P<0.05）。结论  在水痘减毒活疫苗生产过程中应用低血清培养基未影响病毒滴度，但牛血清白蛋白残留量明显降低，减少了因牛源性成分引起疫苗不良反应的风险，可提高疫苗质量，适用于水痘减毒活疫苗的生产。

目的 建立优化的人用H5N1禽流感病毒疫苗生产的工艺。方法 在不同的稀释倍数、收获时间及灭活剂添加量下，通过测量收获液的病毒滴度和血凝效价，来确定病毒的最佳生产条件，并对离心法和凝胶过滤层析法的纯化效果进行对比。结果 用10³～10⁴ 半数鸡胚感染量（50% egg infective dose，EID₅₀）病毒接种鸡胚，收获的鸡胚尿囊液的病毒滴度和血凝效价最高，分别为10^-8.3 EID₅₀和1:480；在56～72 h血凝效价最高。甲醛浓度1 : 10 000灭活144 h为灭活最佳条件。两种纯化方法得到的样品纯度和卵清蛋白的去除率相近，但离心纯化法和凝胶过滤层析纯化法病毒回收率有较大的差异，分别为19%和70%。结论 成功建立了高产毒的鸡胚基质H5N1禽流感病毒培养、灭活及纯化工艺。