2021年, 第44卷, 第5期　刊出日期：2021-10-10

  

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特约专稿
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  基于CRISPR-Cas系统的新一代病原体核酸检测技术

  刘锦嵩 鄢盛恺

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 241-247. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20210729-00045

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  从原核生物的适应性免疫机制衍生出的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat and associated protein，CRISPR-Cas）系统，以其特异性高、可开发性强、简单高效等特点迅速从众多具有竞争力的基因编辑技术中脱颖而出，既为体内基因编辑技术带来革命性突破，也在体外诊断领域开拓了新的方向。近年来涌现出许多快速、便携、经济、高效的基于CRISPR-Cas系统的体外诊断技术，这些技术在病原体检测方面展示出良好的性能，在肿瘤基因诊断、遗传病筛查、移植排斥反应检测等方面也具有很大潜力。此文仅就CRISPR-Cas系统的作用原理、基于CRISPR-Cas系统的检测方法以及在病原体核酸检测领域的应用进展进行简述。

新型冠状病毒专题
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  抗新型冠状病毒受体结合域IgG定量ELISA检测方法的建立、验证及应用

  韩韧 李陶敬 何彦林 侯继峰 周志军 张化俊 彭诚 高晓霄 邓琨 喻剑虹 郑宵蓓 龚钦 冯璐 邢延涛 李策生

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 248-254. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20201019-00100

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  目的  初步建立抗新型冠状病毒受体结合域（receptor-binding domain, RBD)IgG定量ELISA检测方法，用于COVID-19静注人免疫球蛋白的研制中原料血浆、原液和成品的效价检测。方法  将已知的具有中和活性的COVID-19康复者恢复期血浆作为参比标准品，选用RBD抗原包被的间接ELISA试剂盒,采用双对数拟合曲线建立定量ELISA，确定其最佳线性范围；制备室内质控品，并对其进行标定；对该方法进行稀释线性、平行性、准确度、精密度验证。用建立的方法对3批COVID-19静注人免疫球蛋白的原料血浆、原液及成品进行检测，并与化学发光法及中和实验结果进行相关性分析。结果  确定标准曲线线性范围为稀释倍数1～8、批内准确度88.50%~108.58%，批间准确度100.63%~103.98%；批内精密度3.83%~14.68%，批间精密度5.67%~13.15%；标准品和原料血浆、原液、半成品的平行性好。ELISA效价与化学发光及中和实验相关性较好。结论  成功建立抗新型冠状病毒RBD-IgG定量ELISA检测方法，可用于COVID-19静注人免疫球蛋白的效价检测，作为内部放行方法。

疫苗研究
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  甲醛溶液对Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活效果研究

  陈艺元 寇文月 王为 张颖欣 崔子豪 王娇娇 高静 朱秀娟

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 255-258. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20210114-00004

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   目的  验证4%甲醛溶液使Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎（脊灰）病毒达到预期灭活效果所需要的时间。方法  用4%甲醛溶液对15批Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒在(36.5±1) ℃ 环境进行灭活，同时以15批未加入4%甲醛溶液的病毒纯化液作为对照组，按照企业注册标准采用微量细胞病变法测定病毒滴度。为了消除4%甲醛溶液对Hep-2细胞的影响，取4%甲醛溶液接种Hep-2细胞作为实验组，同时设置Hep-2细胞为对照组，每天观察对比两组细胞形态。对同一个Hep-2细胞悬液的总细胞数和活细胞数采用传统手工计数和全自动细胞计数仪计数，并比较分析结果。结果  实验组随着灭活时间的延长病毒滴度呈下降趋势，在灭活到第4天起，3个型别样品均检测不到病毒滴度；对照组病毒滴度在每毫升9.1～10.6 lg半数细胞培养物感染量范围内，符合企业注册标准的要求。4%甲醛溶液对Hep-2细胞生长有抑制作用，在培养观察到第3天时细胞全部失去活力死亡；对照组细胞形态良好呈多边形长成致密单层，活细胞组t值为18.098，总细胞组t值为4.005，P值均＜0.05，差异有统计学意义。结论  脊灰病毒在第4天能被彻底灭活，在进行此实验时应先消除甲醛对细胞培养的影响，避免结果出现假病变现象，确保结果的准确性；应用全自动细胞计数能提高计数结果的精确度。

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  2015—2020年口服轮状病毒活疫苗的趋势分析和质量评价

  张丽君 石岩 刘东梅 刘晨鸣 刘晓凡

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 259-262. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn 311962-20210522-00023

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  目的  统计分析我国2015—2020年口服轮状病毒活疫苗质量属性检测数据，评价其质量可控性和工艺稳定性。方法  根据口服轮状病毒活疫苗注册标准和中国药典（2010、2015、2020年版）规定的方法对634批口服轮状病毒活疫苗的病毒滴度、热稳定性、抗生素残留量、渗透压以及pH进行检测，应用Minitab和GraphPad数据软件对检测结果进行单值移动极差控制图分析、方差分析和箱线图分析。结果  2015年—2020年634批口服轮状病毒活疫苗的病毒滴度均在每毫升5.5～7.0 lg半数细胞培养物感染量（50％ cell culture infectious does,CCID₅₀),热稳定性试验病毒滴度均不低于5.5 lgCCID₅₀/ml、滴度下降不大于1.0 lgCCID₅₀/ml、抗生素残留量、渗透压以及pH均在国家标准范围及企业内控标准范围内。结论 2015—2020年的口服轮状病毒活疫苗产品有较好的质量可控性，生产工艺稳定。

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  水痘减毒活疫苗的稳定性考察

  袁丽 周智雯 景辉 陈哲文

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 263-266. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20200604-00064

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   目的  考察水痘减毒活疫苗（水痘疫苗）的稳定性。方法  取32批由上海生物制品研究所有限责任公司（上海公司）于2013—2019年生产的水痘疫苗，按照水痘疫苗注册标准和中国药典2015年版三部的要求进行各项检定；在0个月进行热稳定性试验，在0和24个月分别进行鉴别试验、外观检查、异常毒性检查、无菌检查和细菌内毒素含量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量、渗透压摩尔浓度、pH值、病毒滴度、水分检测。结果  2013—2019年水痘疫苗在有效期内各项指标检定结果均符合注册标准和中国药典要求。疫苗水分不高于3.0%。病毒滴度在每0.5毫升 3.3～4.5 lg噬斑形成单位。结论  上海公司生产的水痘疫苗安全、有效、稳定。

流行病学
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  2015-2019年西双版纳傣族自治州流行性腮腺炎流行特征分析

  赵双燕 胡筱莛 常志承 李园园 陆大卓 张建中 李海艳

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 267-270. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20210522-00024

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  目的 分析2015－2019年西双版纳傣族自治州（西双版纳）流行性腮腺炎的流行特征，为进一步预防控制流行性腮腺炎提供参考依据。方法 对2015－2019年中国疾病预防控制信息系统报告的流行性腮腺炎病例和暴发疫情资料进行描述性分析。结果 西双版纳2015－2019年共报告2 452例流行性腮腺炎，年平均报告发病率为41.87/10万；男、女性报告发病率比为1.16:1.00；夏冬季为高发季节；0~14岁人群发病率最高（154.39/10万）；总病例的64.23%为学生，7次暴发疫情均发生于学校。2015－2019年共接种136 433剂次含腮腺炎成分疫苗，其中104 133剂次麻疹-腮腺炎-风疹联合疫苗，其余为腮腺炎疫苗。结论 2015－2019年西双版纳流行性腮腺炎发病率呈上升趋势，建议完善麻疹-腮腺炎-风疹联合疫苗儿童免疫规划，提高疫苗接种覆盖率，做好学校晨检工作，加强预防接种证查验工作和流行性腮腺炎的主动监测。

工艺研发
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  SpyTag/SpyCatcher体系蛋白共价连接条件的分析

  王蓓 胡海涛 楼觉人

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 271-275. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20210628-00036

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  目的 比较不同实验条件下SpyTag/SpyCatcher体系共价连接的效率，分析得出优化后的连接条件，为今后相关纳米颗粒疫苗的开发提供实验依据。方法 用大肠埃希菌系统表达分别带有SpyTag和SpyCatcher结构的两种蛋白，摸索共价连接的反应时间、温度、缓冲体系和混合比例，采用非还原型凝胶电泳检测共价连接的效率。结果 反应时间对共价连接的影响有统计学意义（F=22.028，P<0.05），带有SpyTag和SpyCatcher结构的两种蛋白质可形成稳定的共价键，6 h后连接效率约为50%，偶联蛋白在25 ℃稳定存在至少72 h。反应温度和缓冲体系对共价连接的影响没有统计学意义。SpyTag和SpyCatcher结构蛋白比例为物质的量比1.0∶2.0混合。结论 SpyTag/SpyCatcher共价连接体系的关键工艺参数为反应时间，且能适用于多种温度和缓冲条件。

综述
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  基于细胞毒性T淋巴细胞抗原4研发的生物制剂的临床应用进展

  房玉蝶 祝洁 张进安

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 276-281. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20210324-00013

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  免疫疗法是一种快速发展的治疗自身免疫病和癌症的方法。细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）是适应性免疫应答的主要抑制分子，也是该领域最著名和研究最广泛的分子。CTLA-4能够通过多种机制来调节和控制免疫细胞的功能。随着对CTLA-4研究的深入，科学家已经研发出CTLA-4类似物阿巴西普和针对CTLA-4的抗体伊匹木单抗。这两种针对CTLA-4的生物制剂，在自身免疫病和肿瘤疾病的治疗中具有广阔的应用前景。

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  具核梭杆菌与结直肠癌关系的研究进展

  刘智通 徐子昊 伊力其 王悦 刘畅 郭晓奎

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 282-289. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20201023-00105

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  具核梭杆菌（Fusbacterium nucleatum，Fn）是一种革兰阴性厌氧菌，也是人体微生物群成员之一。近年的研究结果表明，Fn载量的增加与结直肠癌的发展与预后密切相关。Fn通过多种机制在调控机体免疫应答、表观遗传及宿主代谢等多个方面促进结直肠癌的发生发展，并能够增强肿瘤细胞对药物的抗性。靶向Fn的新型疗法为预防和治疗结直肠癌等Fn相关疾病提供了新思路，其中噬菌体疗法凭借其精准且安全性好等特性，在Fn相关疾病治疗策略中具备广阔应用前景。此文综述了Fn与结直肠癌相关的致病机制及对治疗和预后的影响，并对噬菌体疗法等多种靶向Fn的新型治疗方法进行了展望。

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  mRNA疫苗作用机制的研究进展

  高雪 成立

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 290-295. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20210620-00034

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  信使RNA（messenger RNA，mRNA）疫苗属于第三代疫苗，即核酸疫苗，具有细胞内表达速度快、有效性和安全性高、反应速度快、易规模化扩大和极具成本效益比等特点，在近30年中取得了突飞猛进的发展，越来越多的证据表明可以用合理的方法来提高这类现代疫苗的有效性和安全性。2020年暴发的由新型冠状病毒引起的新型冠状病毒肺炎大流行给全世界带来了巨大的灾难，导致了过亿例感染和数百万例死亡，疫苗被认为是阻断传播和控制疾病的唯一希望。在所有的疫苗种类中，mRNA疫苗极快的研发速度和有效性引起了广泛的关注。此综述就mRNA疫苗的体内摄取和抗原表达、固有免疫的作用、适应性免疫的激活、mRNA疫苗递送系统以及注射途径的效应等角度进行阐述，以期为mRNA疫苗的设计提供有价值的参考。

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  实时荧光定量PCR技术检测病毒的应用

  董钰莹 朱为

  国际生物制品学杂志. 2021, 44(5): 296-300. https://doi.org/10.3760/cma.j.cn311962-20210420-00018

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  病毒检测在病毒感染的预防、诊断、治疗及病毒性疫苗的质量控制等方面发挥着重要的作用。实时荧光定量PCR通过荧光信号实时检测目的基因扩增数量，是目前实验室最常用的的病毒检测技术，具有灵敏度高、检测快速、污染小等优点。此文对实时荧光定量PCR技术在病毒感染的快速诊断、病毒核酸定量检测和病毒型别的鉴定三个方面的应用进行阐述。