2018年, 第41卷, 第6期 刊出日期：2018-12-10
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 261-265. https://doi.org/10.3960/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.001目的 研究4价流感疫苗所用病毒株在MDCK细胞中的扩增条件。方法 在6孔细胞培养板中以不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）（0.100 0、0.010 0、0.001 0、0.000 1）和对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶（胰酶）浓度（0、2、4、8 μg/ml）进行病毒接种和扩增，感染后72 h收获细胞上清液，检测病毒血凝素效价，确定病毒最佳扩增条件。随后，在搅拌瓶中进行MDCK细胞微载体悬浮培养，研究不同起始细胞接种密度（1.5×105、2.0×105、3.0×105 个/ml）和微载体浓度（3、5、10 g/L）对MDCK细胞生长的影响，确定细胞最佳扩增条件。根据确定的最佳扩增条件，在搅拌瓶培养体系中扩增4种病毒。结果 6孔板中4种流感病毒的最佳接种条件分别是，A/Michigan/45/2015(H1N1) pdm09：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度2 μg/ml；A/Hongkong/4801/2014(H3N2)：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml；B/Brisbane/60/2008：MOI 0.001 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml；B/Phuket/3073/2013：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml。在搅拌瓶中以3.0×105 个/ml初始细胞密度接种，3 g/L微载体浓度培养，MDCK细胞能够实现较好的扩增，最高密度可达2.1×106 个/ml；搅拌瓶悬浮培养，以最佳接种条件接种后，4种病毒的血凝素效价为：6.75~8.42log2 血凝素单位/50 μl。结论 通过摸索病毒接种最佳MOI、TPCK-胰酶浓度及优化MDCK细胞微载体悬浮培养条件，能够在MDCK细胞微载体悬浮培养体系中有效扩增4价流感疫苗用病毒株，为后期工艺放大研究奠定基础。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 266-269. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.002目的 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达甲型H5N1禽流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）并对其进行鉴定。方法 根据sf9昆虫细胞密码子偏好性，对A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）禽流感病毒的HA基因进行序列优化并全长合成。构建重组供体质粒pFastHA，经PCR及测序鉴定后，转化DH10Bac感受态细胞，获得重组穿梭质粒BacmidHA，用M13引物进行PCR鉴定。采用脂质体法转染sf9细胞，获得重组杆状病毒rBacHA。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白质印迹法以及间接免疫荧光法对rBacHA表达产物进行分析。结果 供体质粒pFastHA经双酶切后产生了1条与预期大小相符的1 707 bp条带，序列测定证实目的基因无突变。穿梭质粒BacmidHA经PCR扩增，得到1条与预期大小相符的3 180 bp条带。SDS-PAGE结果显示，rBacHA表达产物的相对分子质量约为65 000。蛋白质印迹法分析表明，表达产物能与禽流感病毒阳性血清结合。在荧光显微镜下，感染rBacHA的sf9细胞呈现绿色荧光，提示HA基因得到表达。结论 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功制备了具有良好抗原性的重组HA蛋白。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 270-275. https://doi.org/10.3960/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.003目的 确定乙型脑炎（乙脑）减毒活疫苗病毒滴定使用的BHK21细胞的密度和代次范围。方法 抽取20批不同代次BHK21细胞在6孔细胞板内培养成单层，进行细胞计数，计算细胞密度，滴定同批次乙脑病毒滴度国家参考品。将BHK21细胞从P95传代至P105，观察细胞形态及生长情况，与已用于检定的BHK21细胞（＜P95）对比。用P95~P105 BHK21细胞重复6次滴定同批参考品，对滴度结果进行双因素方差分析，并与<P95 BHK21细胞的病毒滴度检测结果进行趋势分析比较。结果 20批6孔板单层BHK21细胞密度均值1.55×106 个/ml，差异较大（95%置信区间：7.89×104～3.02×106 个/ml）。病毒滴度结果均在规定范围内（6.48~7.12 lg蚀斑形成单位/ml，相对标准偏差<5%），单层细胞密度对滴度结果无显著影响。P95~P105 BHK21细胞的生长情况及细胞形态与<P95基本一致，病毒滴定结果均在规定范围内。不同试验次数（F=0.13，P=0.721 4）、不同细胞代次（F=1.17，P=0.337 6）及两者的交互作用（F=0.30，P=0.978 0）对检测结果的影响无统计学意义，试验结果与较低代次细胞（<P95）检测的结果趋势一致，均整体稳定。结论 BHK21细胞可连续传代至P105用于乙脑减毒活疫苗病毒滴定，且单层BHK21细胞密度对滴度检测结果无显著影响。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 276-278. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.004目的 研究水痘带状疱疹病毒（varicella-herpes zoster virus，VZV）Oka株的培养特性及对温度的敏感性。方法 对VZV Oka株感染的2BS细胞进行培养，当2BS细胞的致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）达到10%时，开始收集0、3、6、9、12、18、24、36 h的病毒悬液并检测病毒滴度，观察病毒生长曲线。从VZV培养的第1天起，每天检测病毒蛋白浓度，连续检测7 d，观察病毒蛋白浓度变化。将3、12、24、36 h收集的病毒悬液分别于4 ℃和25 ℃放置0、3、6、9、12、24 h，并检测病毒滴度。结果 在2BS细胞的CPE达到10%后0~12 h和12~24 h，病毒生长分别进入对数期和平台期，随后进入衰亡期。在VZV培养过程中，病毒蛋白在经历2 d的初始期后，于2~6 d进入对数期，随后进入平台期。不同生长时期的病毒置于4 ℃的滴度下降幅度和速度都小于置于25 ℃。结论 VZV Oka株具有一般病毒的培养特性，并受温度影响较大。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 279-282. https://doi.org/10.3760/cma.jissn.1673-4211.2018.06.005目的 建立检测黄热病减毒活疫苗中乳糖和山梨糖醇含量的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），并验证该法。方法 建立的HPLC的色谱条件确定为：离子排斥色谱柱 Aminex® HPX-87H （300 mm×7.8 mm），流动相0.004 mol/L硫酸、流速0.8 ml/min、柱温50 ℃，进样量20 µl。检测该法的系统适用性，并验证该法的线性、准确度、精密度、专属性、稳定性和耐用性。结果 该法的乳糖与山梨糖醇峰间的分离度为6.68，乳糖和山梨糖醇标准曲线的线性良好，线性的决定系数分别为0.999 98和0.999 87。该法的准确度良好，乳糖和山梨糖醇的回收率分别为100.2%～100.4%和101.0%～101.7%，均符合规定的要求。 6次重复检测的乳糖和山梨糖醇结果相对标准偏差分别为0.00%和0.08%；2名分析员于不同时间检测12次的乳糖和山梨糖醇结果相对标准偏差分别为0.30%和0.99%。该法检测乳糖和山梨糖醇质量浓度的定量限分别为0.05 mg/ml和0.06mg/ml。结论 建立的HPLC可用于检测黄热病减毒活疫苗中的乳糖和山梨糖醇含量。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 283-286. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.006目的 构建胃泌素多肽G17-白喉毒素A亚单位（diphtheria toxin subunit A，DTA）嵌合蛋白，并初步研究其免疫原性。方法 用酶切法将编码G17的基因与DTA基因连接后，插入载体pET11C，并在大肠埃希菌BL21中表达。先后用阴离子交换色谱法和分子排阻色谱法对表达的目的蛋白进行纯化。用纯化的G17-DTA免疫NIH小鼠，并用ELISA检测小鼠抗G17抗体。结果 构建的G17-DTA嵌合蛋白可在大肠埃希菌中高效表达，表达量达0.5~0.6 mg/ml菌液。经2次纯化后，G17-DTA的纯度可达95%。纯化的G17-DTA在小鼠中诱生了抗G17抗体。结论 构建的G17-DTA嵌合蛋白能在大肠埃希菌中表达，而且在小鼠中具有免疫原性。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 287-290. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.007目的 研制HCV抗原/抗体（HCV antigen/antibody，HCV-Ag/Ab）联合检测试剂，并对其性能进行初步评价。方法 制备2种HCV多表位嵌合抗原和2株抗HCV核心抗原（HCV core antigen，HCV-cAg）单克隆抗体（单抗），经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，制成HCV双抗原夹心与双抗体夹心ELISA检测试剂。用HCV-Ag/Ab联合试剂对903份血液样品进行检测。对于检测结果与HCV-Ab诊断试剂盒不一致的样品，用MP HCV BLOT 3.0确证试剂确认。采用卡方检验对数据进行分析。结果 2种HCV嵌合抗原的相对分子质量约为45 000，与理论预测一致。2株抗HCV-cAg单抗大小正确，且纯度较高。HCV-Ag/Ab联合试剂的特异性达到100%，HCV-Ag检测灵敏度为104 IU/ml，HCV-Ab检测灵敏度为0.1 国家临床单位/ml。联合试剂与HCV-Ab诊断试剂盒检测结果的差异无统计学意义（χ2=0.016 3，P>0.05）。确证试剂对2份HCV-Ab检测不一致样品的确认结果与联合试剂相同。 结论 制备的HCV-Ag/Ab联合检测试剂特异性强、灵敏度高，适用于血液筛查和临床辅助诊断。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 291-294. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.008目的 优化蛋白制备工艺，减少原核表达包涵体变复性产生的多聚体。方法 根据原始工艺进行菌体培养、破壁以及包涵体收集和变复性。然后在包涵体复性液中直接添加硫酸铵固体（优化工艺）。离心去沉淀，收集上清液制备蛋白粗制品。对原始工艺和优化工艺制备的蛋白粗制品进行凝胶蛋白结合量、蛋白回收率、纯化蛋白量以及细胞杀伤活性比较。结果 与原始工艺相比，增加30%饱和度硫酸铵沉淀步骤的优化工艺可使1 ml层析凝胶的蛋白结合量由1 mg提高至20 mg，单位体积发酵液蛋白回收率由10%增加至90%，400 ml发酵液所得的纯化蛋白量由3 mg提升至15 mg。蛋白粗制品的平均半数抑制浓度从0.077 99 µg/ml降至0.045 69 µg/ml。结论 在包涵体复性液中添加硫酸铵可有效减少多聚体。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 295-299. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.009单克隆抗体由于其靶向性强、副作用小等特点，在肿瘤、免疫系统疾病等多个领域取得了良好的疗效，但是由于只能针对单一明确的靶点，在临床上仍存在一定的局限性。因此，可以同时结合两个相同或者不同抗原上的不同表位的双特异性抗体在治疗肿瘤及自身免疫病等领域具有潜在优势。近年来，越来越多不同结构形式的双特异性抗体进入临床并取得了良好的疗效。此文对国内外多种适用于大规模生产的重组双特异性抗体结构及其在临床中的应用进行综述。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 300-305. https://doi.org/10.3670/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.010Ⅰ型干扰素（type Ⅰ interferon，IFN-Ⅰ）具有广谱抗病毒免疫保护效应，已在临床上用于治疗多种病毒性疾病。IFN-Ⅰ与特异性受体结合后，触发一个极其复杂的信号通路网络，诱导产生大量抗病毒蛋白来发挥抗病毒和免疫调节作用。在急性病毒感染如高致病性H5N1禽流感病毒感染中，IFN-Ⅰ信号通路过度活化诱发的细胞因子风暴会促使病情进一步恶化。而在慢性病毒感染如慢性HCV感染中，IFN-Ⅰ在发挥治疗作用的同时还能引起一系列病理效应。因此，探索在病毒性疾病发生发展进程中适时激活或阻断IFN-Ⅰ信号通路的研究，将有助于指导临床合理高效地使用IFN-Ⅰ。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 306-309. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.011含有4-氨基-2,4-戊二烯酸的环缩酚酸肽类天然产物是一类包含酯键的环状多肽次级代谢产物，通常具有抗肿瘤、抗病原体等生物活性。此文根据国内外最新研究现状，介绍了这类物质的来源、结构、制备现状、生物活性以及开发前景。
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国际生物制品学杂志. 2018, 41(6): 310-312. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn.1673-4211.2018.06.012此文介绍了HIV感染者接种脑膜炎球菌结合疫苗的免疫原性和安全性等相关情况。通过对支持证据进行评级，建议对2月龄以上HIV感染者进行脑膜炎球菌结合疫苗接种，并明确了具体接种程序、接种注意事项及接种禁忌等相关意见。
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